Xác định hoạt độ enzyme amylase theo phương pháp WOHLGEMUTH

Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



Lấy ống nghiệm còn lại (ống thứ 11) cho vào 3 ml nước cất, 2 giọt thuốc thử Iodine

trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzym thấp

nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin.

1.2 Tính kết quả

Lượng enzyme được cho vào ống nghiệm (1):



n=

Trong đó:

V1- Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml)

V2- Thể tích dịch chiết enzyme (100 ml )

m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg)

Một đơn vị Wohlgemuth (W):



W=

Trong đó :

F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh

bột ( ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW):



Nw =

2



Xác định hoạt độ lipase

54



Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



2.1 Nguyên tắc

Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo.Hàm lượng acid

được chuẩn độ bằng kiềm.Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòa acid mới

được hình thành.Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng

enzyme.





Hóa chất



Đệm acetate pH=4,7 ( trộn CH3COOH 1N và CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1), cồn 960,

toluen, ether ethylic, NaOH 0.1 N, Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với

50 ml ethanol và 50 ml nước cất.Dầu đậu nành tinh khiết.





Tiến hành



Cân 5g hạt đậu nành, nghiền thành bột mịn bằng cối sứ. Chuyển vào erlen, thêm

10ml nước cất, lắc đều trong 15 phút ở 30 oC.

Cho thêm vào 1ml dầu đậu nành làm cơ chất và 5 ml đệm acetate với vài giọt

toluene, lắc đều hỗn hợp ở 30 oC trong 24 giờ. Khi hết thời gian phản ứng, cho vào mỗi

bình 25ml cồn 96o và 15ml ether, lắc đều và để yên 2 phút.

Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein 1%.

Lặp lại thí nghiệm 3 lần.Làm bình kiểm chứng tương tự như trên nhưng dịch chiết

enzyme phải được đun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính trước khi cho cơ chất vào.

2.2 Tính kết quả

Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự

do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ :



X=

Trong đó:

a : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình thí nghiệm

b : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình kiểm chứng

k : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1 N

55



Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



m : khối lượng hạt sử dụng

3 Khảo sát hoạt độ invertase

3.1 Nguyên tắc

Invertase là một enzyme thủy phân saccharose thành glucose và fructo se.Dựa vào

tính chất Iodine trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác dịnh lượng

glucose sinh ra bằng cách định phân Iodine dư với dung dịch Na2S2O3.

Hóa chất









Saccharose 10%

NaOH 0,1N: hòa tan 4 g NaOH cho đủ 1000 ml bằng nước nước

cất.

Iodine 0,1N: cân 40 g KI và hòa tan với 100 mL nước cất trong bình cầu 1000ml. Cân 12.7 g I2 cho vào bình cầu trên và lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Nhỏ 3



giọt 37% HCl. Định mức cho đủ 1000 ml bằng nước cất.

H2SO4 1N: hòa tan 27.7 ml H2SO4 96% cho đủ 1000 ml bằng

nước cất.

Hồ tinh bột 1%: 1 g hồ tinh bột hòa tan trong 100 ml. Đun cách thủy trong 15

phút.

Dung dịch Na2S2O3 0,05N: cân 12.5 g Na2S2O3.5H2O trong nước cất cho

đủ 1000 ml.

3.2 Cách tiến hành





Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hòa tan vào 50ml nước cất, cho vào

bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút. Để lắng, lọc lấy dịch lọc.

Thực hiện 3 ống nghiệm như sau:

Bảng 5: Chuẩn bị ống nghiệm

Số ống



1



2



3



Dung dịch saccharose 10% (ml)



0



10



10



Nước cất (ml)



10



0



0



Dịch enzyme (ml)



10



10



0



Dịch enzyme đã đun cách thủy 10

phút



0



0



10

56



Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



Để 3 ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong chính xác 30 phút sau đó dem

đun cách thủy trong 10 phút.Ở từng ống nghiệm, hút ra 5ml hỗn hợp dung dịch cho vào

một bình tam giác 250ml để xác định hàm lượng glucose

Xác định glucose: thêm vào mỗi bình tam giác 10ml dung dịch iodine 0,1N và 15ml

NaOH 0,1N.

Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH vào sao cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2

phút.Để yên trong bóng tối 20 phút.Lấy ra, thêm vào 2ml H2SO4 1N.Định phân lượng

iodine thêm thừa bằng Na2S2O3 0,05N với hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị.Lặp lại thí

nghiệm 2-3 lần

3.3 Tính kết quả

Hoạt độ của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy phân bởi lượng

ezyme có trong 1g men bánh mì trong một phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm



Trong đó:

V1: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1

V2: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2

A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (ml)

B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì

(ml)

a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml)

b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

4 Khảo sát động học và xác định hoạt độ enyme urease

4.1 Nguyên tắc

Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng:



57



Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene tetramine và giải

phóng acid carbonic.

2(NH4)2CO3 +



6HCHO



(CH2)6N4 +



2H2CO3



+



6H2O

Dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lượng acid tạo thành sẽ tính được lượng urea

bị thủy phân.

Hóa chất











Ure 2%, 1/3 M

Formol trung tính: cho 10 ml dung dịch 10% formol và erlen, bổ sung 2 ml

0.5%phenolphtalein. Nhỏ từng giọt 0.2N NaOH vào erlen cho đến khi xuất hiện

màu hồng nhạt của phenolphtalein.Ghi nhận lượng 0.2N NaOH đã sử dụng (V

ml). Căn cứ tỉ lệ dung dịch 10% formol và 0.2N NaOH đã sử dụng, tiến hành điều

chế 100 ml 10% formol trung hòa (không được sử dụng phenolphtalein).

Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với 50 ml ethanol và 50 ml

nước cất.



4.2 Cách tiến hành









Điều chế dung dịch urease

Cân 10 g đậu nành đã được xay thành bột khuấy vào 150 ml, cho vào bình định

mức 250ml, định mức tới vạch bằng nước cất. Lọc và thu dịch lọc.

Khảo sát động học



Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống.Ở từng dãy cho lần lượt các dung dịch vào

theo bảng sau:

Bảng 6: Chuẩn bị dung dịch mẫu

Ống nghiệm



1



2



3



4



5



6



Ure1/3

(ml)



M



0



1



2



4



4



5



Nước



cất



5



4



3



2



1



0

58



Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



(ml)

Dd

(ml)









urease



5



5



5



5



5



5



Đặt dãy thứ nhất vào bể ổn nhiệt 40 oC, dãy thứ 2 vào tủ ấm 30 oC trong chính

xác 20 phút.

Sau khi kết thúc thời gian thủy phân thì thêm vào mỗi ống nghiệm 5ml formol

trung tính, lắc đều trong 2phút.

Chuyển từng ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với một ít nước cất.

Thêm vài giọtphenolphthalein 1%, định phân với NaOH 0,05N.Lặp lại thí nghiệm 3

lần.



4.3 Tính kết quả:

Ở mỗi dãy ống nghiệm, tính toán kết quả và ghi vào bảng sau:

Bảng 7: Kết quả thí nghiệm

Ống nghiệm



1



2



3



4



5



6



NaOH dùng chuẩn độ (ml)

Y= số mol ure bị phân hủy

(mol)

[S] =số mol ure ban đầu







Trên cùng một hệ trục tọa độ vẽ 2 đường cong biểu diễn lượng cơ chất bị thủy phân

theo nồng độ cơ chất ban đầu ở 2 nhiệt độ ( Y1 và Y2 theo [S])

Vẽ đường thẳng biểu diễn sự biến thiên của 1/v theo 1/[S] ở 2 nhiệt độ

thủy phân.



Trong đó:

v= d(S)/dt = Y/20 (v là vận tốc phản ứng thủy phân)



Trong đó:

Vmax: vận tốc thủy phân cực đại

59



Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



[S]: nồng độ cơ chất

Km: hằng số Michaelis-Menten

Các đường thẳng này sẽ cắt trục hoành và trục tung tại các giá trị nghịch đảo của của

Km và Vmax.Hãy tính các trị số này ở từng chế độ nhiệt.

Xác định hoạt đô ô:

Thực hiện các ống nghiệm sau:

Bảng 8: Chuẩn bị ống nghiệm

Ống nghiệm

Ure 2% (ml)

Nước cất (ml)

Dd urease (ml)

Dd urease đã đun cách thủy (ml)



1

0

5

5

0



2

5

0

5

0



3

5

0

0

5



Mang tất cả các ống nghiệm đặt ở 40oC.Sau 20 phút cho vào mỗi ống 5 ml formol trung

tính, lắc đều trong 2 phút.Đổ lần lượt mỗi ống ra một erlen 100ml. Định phân bằng

NaOH 0,05N với phenolphtalein 1% làm chỉ thị.Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Tính kết quả: hoạt

đôô urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme urease có

trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC.

Trong đó:

V1, V4: số ml NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1 và 2

a: Thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm

A: Tổng thế tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu cân

k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05 N

5. Xác định hoạt độ của enzyme peroxidase

Enzyme Peroxidaza rất phổ biến trong thực vật và đóng vai trò quan trọng trong các

quá trình oxy hóa.Peroxidaza làm hoạt hóa các peroxide đặc biệt là H 2O2. Peroxidaza

xúc tác các phản ứng oxy hóa nhiều polyphenol và amin thơm tạo thành các phẩm vật

khác nhau.

5.1 Nguyên tắc

60



Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



121160



Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme peroxidaza phổ biến là phương pháp dựa

trên sự oxy hóa pirogalol thành purpurogalin khi có H 2O2.Phản ứng xảy ra theo sơ đồ

sau:

Purpurogalin tạo thành dưới dạng kết tủa màu nâu không tan trong nước, nhưng rất

dễ tan trong eter và H2SO4 đậm đặc.Tùy thuộc vào cơ chất được chọn dùng pH tối thích

mỗi enzyme peroxidaza có thay đổi chút ít.

Đa số trường hợp thí nghiệm được tiến hành trong môi trường kiềm yếu hoặc trung

tính ở nhiệt độ thường 20 0C.Độ nhạy với nhiệt của enzyme peroxidaza rất cao, nó có

thể bị vô hoạt ngay sau khi sôi.Độ nhạy của nó đối với sự dư H 2O2 cũng rất lớn, do đó

tiến hành xác định hoạt độ của enzyme trong những thể tích lớn, pha thật loãng.

Lượng purpurogalin tạo thành có thể xác định bằng hai cách:

-



Kết tủa purpurogalin sau khi lọc và rửa sạch, hòa tan bằng H 2SO4 80% đem

chuẩn bằng KMnO4 0.1N.

Kết tủa purpurogalin rửa sạch, hòa tan trực tiếp bằng eter và đem xác định

bằng phương pháp so màu, đối chiếu với purpurogalin tinh khiết tan trong

eter.



Chú ý: Khi xác định hoạt độ enzyme Peroxidaza bằng phương pháp dùng piroganol làm

cơ chất cần chú ý là piroganol và H 2O2 dùng trong thí nghiệm có ảnh hưởng rất lớn đến

hoạt độ của nó, do đó lượng dùng trong thí nghiệm không được quá giới hạn xác định.

Ngoài ra phải tuân theo một cách nghiêm ngặt các trật tự quy định khi trộn lẫn thuốc thử

và dịch chiết enzyme vào dung dịch H2O2 khi chưa thêm pirogalol.

Hóa chất

Dung dịch H2O2 1%, dung dịch pirogalol 1% pha trước khi dùng H 2SO4 đậm đặc ( d =

1.84 ); H2SO4 80%, KMnO4 0.1 N, Eter etylic, Purpurogalin tinh khiết, dung dịch đệm

phosphate pH = 8 ÷ 9.

5.2 Phương pháp thực hiện





Chuẩn bị dịch chiết peroxidaza:



Cần lấy vào cối sứ 2 -3 gram nguyên liệu (lá, rễ, hạt,).Nghiền thật cấn thận với 20ml

dung dịch đệm phosphate pH = 8 ÷ 9, có thêm 4 giọt toluene hoặc chloroform và bột

thủy tinh hoặc cát sạch (không có Fe). Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức

100ml bằng dung dịch đệm và sau đó thêm dung dịch đệm cho đến vạch. Lọc nước thu

được dùng để xác định hoạt động của enzyme peroxidaza.

61