Phương pháp chủ động tạo biến di trong chọn giống hiện đại

A.Lai giống

Giống vật nuôi, cây trồng là tập hợp sinh vật

Người ta thường sử dụng nguồn nguyên liệu nào để chọn tạo giống

Ưu thế lai là hiện tượng con lai:

Khi nói về ưu thế lai, phát biểu nào sau đây đúng?

Ưu thế lai thể hiện rõ nhất ở đời con lai F1 của phép lai?

Bước chuẩn bị quan trọng nhất để tạo ưu thế lai là

Giao phối cận huyết được thể hiện ở phép lai nào sau đây:

Khẳng định nào sau đây về tạo giống ưu thế lai là không đúng?

Nguyên nhân của hiện tượng thoái hóa giống là:

Tự thụ phấn sẽ không gây thoái giống trong trường hợp:

1. Phương pháp lai hữu tínhChương 5Phương pháp tạo biến dị ditruyền trong chọn giống cây trồng• Sự giao phối có thể xảy ra trong tự nhiên (lai tựnhiên) hoặc do con người tiến hành (lai nhântạo) đều tạo ra biến dị tái tổ hợp và có giá trịtrong chọn giống cây trồng.• Khi bố mẹ khác nhau 2 cặp gen alen ở thế hệ F2sẽ thu được 2 kiểu gen mới,• nếu bố mẹ khác nhau 3 cặp gen alen ở thế hệF2 thu được 6 kiểu gen mới.• Tổng quát khi lai hai bố mẹ khác nhau n genalen, sẽ có 2n giao tử và số kiểu gen là 3n.• Quần thể nhỏ nhất ở F2 cần thiết để biểu hiệncác biến dị là 4n cá thể.• Phương pháp lai hữu tính tạo giống thườngđược ứng dụng đối với cây trồng có cấu tạo hoahoàn chỉnh.• Đối với thực vật có cấu tạo hoa hoàn chỉnh gồmđủ cả nhị và nhuỵ thì cần tiến hành khử đực(emasculation) ở cây mẹ trước khi tiến hành lai.• Các loài cây trồng có sinh sản đặc thù như: bấtdục đực (male sterility), đơn tính cái(Gynoecious), tự bất hợp (self - incompatibility)do yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất haydo yếu tố môi trường có thể lợi dụng hiện tượngnày để giảm bớt công khử đực, hạt thu đượctrên cây mẹ là hạt lai• Khái niệm:“Lai giống là sự giao phối (thụ phấn, thụtinh) giữa hai hay nhiều dạng bố mẹ cónền di truyền khác nhau để tạo ra biến dịtái tổ hợp theo mục tiêu chọn giống ”.Ví dụ: Lai 2 bố mẹ khác nhau 3 cặp gen alen tạora các kiểu gen mới như sau:P1AAbbCC xaaBBccP2F1AaBbCcF2AABBCCKiểu gen mớiAABBccKiểu gen mớiAAbbCCKiểu gen bố mẹAAbbccKiểu gen mớiaaBBCCKiểu gen mớiaaBBccKiểu gen bố mẹaabbCCKiểu gen mớiaabbccKiểu gen mới• Lai hữu tính tạo giống được phân chia thànhlai gần và lai xa:– Lai gần là lai giữa hai bố mẹ trong cùng loài. Ví dụ, laigiữa các giống trong mỗi loài lúa trồng Oryza sativaL. (châu Á), O. glaberrima (châu Phi)…– Lai xa là sự giao phối giữa hai bố mẹ khác loài haykhác loài phụ. Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụlúa Indica x Japonica; lai giữa loài khoai tây trồng(Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại(Solanum demissum) hay lai giữa chi (genus) lúa mỳ(Triticum) với mạch đen (Secale) tạo ra cây Triticale.15.1.2. Các phương pháp lai hữu tínha) Lai đơn(single cross): là lai một lần giữa hai bốmẹ, phương pháp này ra đời sớm nhất, đượcsử dụng rộng rãi và rất hiệu quả đến ngày nayvì nó đơn giản, ít tốn kém, không yêu cầutrang thiết bị và cơ sở vật chất lớn.Công thức như sau:AxBKý hiệu: A/B (theo IRRI và USDA)hoặc A - B (theo CIMMYT).c. Lai kép (double cross):• Phương pháp lai giữa hai con lai F1 củahai lai đơn, công thức lai:(A x B) (C x D)• Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA);A/B//C///D (theo IRRI);A – B x C - D (theo CIMMYT).Dòng 1Dòng 2TesterDòng 3***b) Lai ba (three-way cross)• Phương pháp sử dụng con lai F1 của củamột lai đơn lai với một bố mẹ khác. Côngthức lai (A x B) x C• Ký hiệu A/B//C (theo IRRI và USDA) hoặcA - B x C (theo CIMMYT).d. Lai đỉnh (topcross): thường được sửdụng để xác định khả năng kết hợp chungnhằm loại bỏ các dòng/giống không cókhả năng tổ hợp trong tạo giống ưu thế lai.Các dòng/giống mang lai thử được lai vớivài ba giống ổn định về khả năng kết hợpchung (thường là có khả năng kết hợpchung thấp) và phổ di truyền rộng gọi làtester (vật liệu thử). Kiểu lai này còn đượcgọi là lai thử (line x tester).e. Lai dialen (diallel cross): là kiểu lai giữamột số dòng/giống nghiên cứu (thường từ6-8 dòng/giống) mà mỗi mẫu giống đượclai lần lượt với các mẫu giống còn lại. Lailuân giao dùng để xác định khả năng kếthợp chung và khả năng kết hợp riêng củacác dòng/giống trong chọn giống ưu thếlai.Dòng nHình 5.1. Sơ đồ lai đỉnh2Griffing (1956) đưa ra 4 phương pháp lai như sau:• Phương pháp 1: Lai thuận, lai nghịch và tự phối(bố mẹ) và số tổ hợp lai = p2• Phương pháp 2: Lai một chiều và tự phối (bốmẹ) và số tổ hợp lai = p(p + 1)/2• Phương pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tựphối và số tổ hợp lai = p(p - 1)• Phương pháp 4: Lai một chiều không tự phối vàsố tổ hợp lai = p(p - 1)/2ABCDAAxAAxBAxCAxDBBxABxBBxCBxDCC xACxBCxCCxDDD xADxBDxCDxDHình 5.2. Sơ đồ lai dialen theo phương pháp 1 của Griffingg. Lai thuận nghịch (reciprocal cross): là haicặp lai đơn mà vị trí bố mẹ được đổi cho nhau.Lai thuận nghịch được sử dụng để xác định sựkhác nhau hay không về tế bào chất của hai bốmẹ; khi có sự khác nhau về tính kết hạt của haicây bố mẹ có ưu thế lai F1 như nhau, lúc nàynên chọn cây có hạt nhiều làm mẹ.A♀ x B♂Lai thuậnB♀ x A♂Lai nghịchh. Lai lại (backcross) là lai giữa con lai (làm mẹ)với một trong hai dạng bố mẹ. Kiểu lai này cònđược gọi là “lai tích luỹ”.Lai lại được áp dụng chuyển gen mong muốn vàomột giống hay một dòng ưu tú như chuyển genkháng bệnh, lấy lại gen nhân của dòng bố(mẹ) khi lai chuyển gen bất dục đực trong tạodòng bất dục đực CMS, giảm bớt gen khôngmong muốn của một bố mẹ trong quá trình lai.Hình 5.3. Lai thuận nghịchh) Lai trở lại nhờ marker(Marker-assisted backcrossing - MAB)• Phương pháp MAB được tiến hành kết hợp giữaphương pháp truyền thống (sử dụng phươngpháp lai lại) và phương pháp hiện đại (sử dụngchọn lọc marker phân tử). Sau khi tiến hành lailại, ngay ở thế hệ đầu tiên (BC1F1), các cá thểcó kiểu gen mong muốn được chọn lọc thôngqua biểu hiện của các marker. Các cá thể nàycó thể được sử dụng để lai lại cho các thế hệsau hoặc tự thụ tuỳ thuộc vào mục tiêu chọngiống3c. Lai hồi quy: là kiểu lai giữa hai hay nhiềucặp lai tích luỹ với nhau với mục đích bổsung nhiều đặc tính tốt cho con lai.a. Lai nhiều bậc (convergent cross): làkiểu lai giữa con lai đơn với một giốngcó đặc tính mong muốn, con lai nhậnđược tiếp tục lai với một giống khác cóđặc tính mới và cứ như thế có thể tiếptục lai với nhiều giống mà mỗi giống cómột ưu điểm riêng.Beloturca x PotapcaAlpha x XarozaAlbidum-24 x Liutexen55/11Xaratopca-29Hình 5.7. Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P. Sekhudin)d. Lai phức tạp: Lai giữa các con lai haythụ phấn hỗn hợp những hạt phấn củamột số dạng bố cho một giống mẹ.k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization)Phương pháp lai các cặp bố mẹ tạo các lai đơn và cuốicùng lai các lai đơn với nhau.Hình 5.8. Sơ đồ lai nhiều bố mẹ4TGST ngắng. Lai quy tụ gen dựa trên marker phântử (pyramiding)Tương tự như phương pháp trên, lai quy tụgen cũng dựa trên marker phân tử ADNliên kết với các gen mục tiêu sẽ giúp choviệc chọn lọc được dễ dàng. Để tiến hànhđược phương pháp này các nghiên cứucần tạo ra các dòng đẳng gen (NIL –nearly isogenic line). Sau đó, các dòngNIL này được tiến hành lai với nhau. Khichọn lọc sẽ sử dụng các marker liên kếtvới các gen mong muốn để chọn lọc.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Năng suất cao1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112Kháng rầy nâu và bạc lá1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112Dòng/ giống mới quy tụ các gen quy định tính trạng mong muốn ở lúaTGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc lá – O. longistaminataPhương pháp lai tế bào soma (Somatichybridization) được tiến hành lai ở mức độ tế bàoCác bước lai tế bào soma:• Bước 1: Phân lập tế bào soma từ mô lá củacây con, tinh sạch– Cây bố mẹ được nuôi cấy in vitro tạo cây con trênmôi trường MS (Murashige và Skoog) có bổ sungthêm các hóa chất khác phù hợp với yêu cầu nuôicấy của mỗi loài. Cây bố mẹ cũng có thể trồng trongđiều kiện nhà kính, nhà lưới hoặc trên đồng ruộng.Mô lá của cây con sử dụng nuôi tạo calus để tách tếbào trần (protoplast).– Phân lập protoplast bằng các enzyme nhưcellulase C1, xylanase, và pectin lyase, khi xửlý các enzyme có thể gây tổn thươngprotoplast cần có nghiên cứu để tránh tổnthương như nghiên cứu của Shigetaka Ishii(1988) phân lập protoplast tế bào lúa trongmôi trường bổ sung thêm AgNO3 đã tăng sốdòng nhân nhưng năng suất protoplast giảm.Bổ sung thêm superoxide dismutase vàcatalase cải thiện sự sống sót của protoplastrõ rệt.• Bước 2: Lai tế bào soma và kiểm tra tế bàolai– Dùng pipet hút tế bào trần (khoảng 150µl) đưa lênmiếng giấy nhỏ (cover slip) kích thước 22 x 22 mm,đặt miếng giấy vào đĩa petri (60 x 15mm). Nhỏ mộtgiọt nhỏ silicone để giữ miếng giấy, sau 5 phút cốđịnh protoplast. Bổ sung 450µl dung dịch PEG (P2)đưa vào nuôi cấy.– Kiểm tra tế bào lai bằng phân tích isozyme, xác địnhđộ bội theo phương pháp của Grosser (1990), phântích marker phân tử RAPD sử dụng ADN tách chiết từcác tế bào lai đã tái sinh, đồng thời với bố mẹ chọnlọc các tế bào lai thành công.• Bước 3: Tái sinh câyTách tế bào lai chuyển lên đĩa petri nuôi cấytạo calus, tạo rễ và tái sinh cây. Môitrường điều kiện nuôi cấy tùy thuộc vàoloài cây trồng. Điều kiện nhiệt độ, ánhsáng và độ ẩm môi trường nuôi cấy đượcđiều chính phù hợp.5Bước 4: Đánh giá và chọn lọc các thế hệ saulai tế bào soma• Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau lai thựchiện tương tự như lai hữu tính, đặc thù của lai tếbào soma con cái các thế hệ sau lai có thể xảyra biến dị soma do nuôi cấy ngoài biến dị tái tổhợp do lai. Do vậy cần xác định nguồn biến dịtrong quá trình chọn lọc.• Lai tế bào soma thường được sử dụng lai xa (laikhác loài) do vậy con cái có thể xảy ra bất thụ,trong quá trình chọn lọc áp dụng các biện phápkhắc phục trở ngại con lai bất thụ như lai xa hữutính.1.2 Lai xangut• Dou trong lai xa tăngang cây ng i cun, sâu nh…ng nhningnhc xa nhaunt din cho nênp ti,i sau phân linh,ngct… nênn c onhngi c nh ng cti.ini• Nguyên lý chọn cặp bố mẹ (5)• Gieo trồng, chăm sóc vườn cây bố mẹvà chọn cây bố mẹ• Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai• Khử đực và bao cách li• Thụ phấn và đánh dấu• Chăm sóc và thu hoạch hạt laiNhững ứng dụng của lai xaLai xa là sự giao phối giữa các cá thể của hai loài trở lên.Ví dụ: lai giữa loài khoai tây trồng (Solanum tuberosumL.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay laigiữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen(Secale) tạo ra cây Triticale.•Kỹ thuật lai giốngKhó khăn khi lai xa• Bất hợp lai, không tạo ra F1: do không hài hòatrong hệ thống sinh lý của cây.• F1 không có khả năng sống do bất dục NST,Không hài hòa giữa nhân và tế bào chất giữacác loài• F1 bất dục: sự bất dục NST hay sự không hàihòa của kiểu gen.• Sự suy nhược của con lai: có trường hợp thuđược F1 có sức sống cao, hữu dục nhưng F2 lạiyếu và bất dục• Chuyển gen mong muốn từ loài tổ tiên hoangdại hoặc loài, chi có quan hệ họ hàng sang cácgiống cây trồng, đặc biệt là các gen kháng sâu,bệnh, bất dục, chống chịu...• Tận dụng sức sống con lai ở những loài nhấtđịnh• Tạo ra các loài đa bội khác nguồn mới, nhưtriticale• Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.Phương pháp khắc phụca. Cản trở trước khi thụ tinh- Chọn loài bố mẹ để lai- Số tổ hợp lai: lai thử với số lượng lớn.- Lai thuận nghịch- Tăng mức bội thể- Lai gián tiếp- Cải tiến kỹ thuật lai: ghép phôi, hỗn hợp hạtphấn, sử dụng dung môi hữu cơ, cắt bỏ đầunhụy trước khi thụ phấn, xử lý chất điều hòasinh trưởng, cắt ngắn vời ngụy, dung hợp tế bàotrần, thụ phấn in vitro...6Một số thành tựu lai xab. Cản trở sau khi thụ tinh:- Sử dụng hormon sinh trưởngphấn hỗn hợp- Cứu phôi- Ghépc.suycF2- Gieo ng inni hi ngngp genNST cân ng- Lai iu n ii giaoo ra• Cây lương thực- Lúa: chuyển gen kháng c Xa21i a i O. longistaminata, genvirus…i Triticale con laiaach.• Cây ăn quải Tangeto con laiai C. xparadisi it C. reticulata.Ý nghĩa của đột biến•• Đột biến là cơ chế chủ yếu tạo ra biến dị ditruyền ở mọi cơ thể sống.• Đột biến ở thực vật là những thay đổi di truyềnđột ngột xảy ra trong toàn bộ vật chất di truyền(DNA) của cây.• Đối với chọn tạo giống, đột biến cung cấp nguồnvật liệu di truyền mang các tính trạng mới đểtrực p hay gián tiếp tạo ra giống mới.•t phươngpsung cho c phươngpnngcc nhân-c nhânngây ra-tnc(cioncioni NST, t tattncuc nhânionttnacnhta):caomthưam••••at, phươngp tc p ng khi:c2. Phương pháp đột biếnngnnnnhiên khôngnh ngmongn.nh ng mongntrong cây ng nhưngliên tt i nh ng không mongn.tng ưu đang gieo ng n i ntnh ng đơnn.nh ng mongntrong cây i nhưnglailiên tt i nh ng khôngmongn.nni cây sinh n ng conngvô nh (cây nh, cây ăn)ngng onhau (Micke, 1990)nhcc nhântncc nhânĐBCây ssng tCây ss sinhngTia gamma366204570Tia X6522729236134917724811495ngngu gây racc mTrungcc nhâncac7cciontrongccnTia gammangcgâyNguymngng(60Co, 137Cs);ngt ch0,1AoNguymnn2800-2900 Aoc mnguyNeutron(nhanh,m,.t---n ngchttnantTêni10-3 – 10nmc mc nhânc thôngcng/ngy X quangTia XTiaa thôngtnEthyl methane sulphonateKhôngngngng0,1 – 0,3%uN-methyl-N-nitrozo ureC.n,ung0,01 – 0,03%N-ethyl-N-nitrozo ureC.n,ung0,01 – 0,03%Natri azid (NaN3)C.n,ung0,001 – 0,004Mmt nguymngt)u.ngung:ungu (R) = năngngt rancRoentgen (R) =erg/g ttung p(rad) = năngngt raacn sang ingcing prad (r) =erg/g ttu gâyt (LD50): ungsau khi%cây ng tnăng ra hoa, t t.• Phươngp:cion a n:+i gianu+ung n+m+t+ngoxyKhitn ungp hơnu soi ung i ưu.nn, trongng ungccn ng chtng ch nhautngi giantnht•tphươnguu:yngn–––––•cây: cây con,t: t u ngtncn sinhnh sinhngo trong nuôipi câyc nhau:tngnci câynng:tnh giâm,t,yc nhân a c:ngn ra ngâmu trong dungch.ncn cnp onghiêmt.+ccng n nh: m trươngt trongc,at, a ch,phơi khô t.+c c nhân nhng:ngat,t ,pH,i gian( g),ch dung ch ( pnch tc)+8. Quyng t.•nhncn cây sinh sảnt.ctni nhng đơn gen:ngt ng c nhân gây tn;c câyM1tnm;n cây;anghat/ bông a cây thu riêng; Đem gieo osau (M2).: Gieo t a c câyn theo ng; Quan t nh;n cch.: Gieo c tn M2nh ng riêng M3;ing ng khôngtn tn; Thu hoach M3.: So nh sơbao ming;nnc ng ưuso nh p ium.M5 – M8: p i c so nhu a phương;ng ng i tcngi.••••. Quy nhn vô nh•-nctQuy• B :• B :VM3;ng VM2;mngnh ngt din trong ng tn.p c phân p tn somanhân cây tn.nhsơctn.:ngtpctanhnh nng vô nh.nng đa geni nh• Côngc n nh gieo ng nhưngp trên nhưng công cn cnhơn yc ogenmt chonêni giannng lâu hơnn cây sinhci tn theot sinh mô anh sinhng bao m c ng sau:m ngnm ngm nhttnnn• B –Bcnh phânt• B :m,t• B :ptVM1;nptnnmi VM1,tnp…VM2; ng VM1; c nhn; ti không tnhn.3.Ứng dụng đa bội thể và đơnbội thể trong chọn giốngnh9. Đaa•ia đaitrongng sinh t trongng NST tăng theoNST đơn i (nnhiênno sinhnginguyênlên)c itngn ađai•nngn cây t n ( – %).n n cây nuôi ngii như a ,a, khoai tây, khoai lang…•n ngng NST, ct đa i, ng vaiquan ng trong nhnhi.nh n a ainhnng i sang đa i• Trong n a, đa imu gentăngm năng ip.Quanancngtađa inhiênđaXi – xin36 - 3837,0Hungari44 - 4948,6Trung Âu46 - 5550,7Đan54 - 5853,560 - 6274,063 - 6671,26859,3Spitsbergen77 - 8174,0o Peary82 - 8485,9chTây nam Greenlando băngTâyc Alaska•đa inhp cao hơnng i nênc ngưulai cao hơn.•c ng ng đa itrongn ong n n t ndo trongung p cđa i nhân ounincân ng din.• Trongnhiên,đa itươngquan icao.ctrongitnng n hơnum hơn.• Sinhngm hơntc giain sinhng.•u cp hơnng i, donăng nt t laikhăn. Đang caoct c ng n.• ngn sinhngm hơn câyng i.c. Đa(%)nh đaiiingn (autopolyploid)• Đa ic i theo iaNST cơn (tam i – n;i – 4n)•ong n hơn ngi.•y hơn ii/ nghơn.ng xanh mn hơn.•oung n hơn, trongo oang pu hơnn đaDi•ngPAA x aaF1AaniAAAA x aaaao0,5 A; 0,5anhF10,167 AA; 0,667 Aa; 0,167 aaphân lyngngAAaaGiaoiiiF2i0,5A0,5a0,5A0,25AA0,25Aa0,5a0,25Aa0,25aa10phân lyF2ci0,167AA0,667Aa0,167aa0,167AA0,0278AAAA0,1111AAAa0,0278AAaa0,667Aa0,1111AAAa0,4444AAaa0,1111Aaaa0,167aa0,0278AAaa0,1111Aaaa0.0278aaaaPhươngpo đaingngno đa i ng conng nguyên phân:ng c c nhân ng, nh,c gây mê…c ng onh phân chiamm.•conchicine (C22H25NO6) hayN2 Oun pt caoacenapthane.cty mtc năng a thoi vô c m choNST n phân chia nhưngm ckhôngc oc, onhoiNST tăng p đôi.• Nuôi y môo đa ing conngu nh haymmngu genF2ii0,25 AA0,50 Aa0,25 aa•a o cơgiao khôngmm 2n.•ng giaoyng NSTtương như trongo soma.•ngiaoncmt din nhưngnhngnh ini nh.mng đa0,0278 AAAA (Quadriplex)0,2222 AAAa (Triplex)0,5AAaa (Duplex)0,2222 Aaaa (Simplex)0,0278 aaaa (Nulliplex)ing• Dưa u tam i không•ing tam i• Nhoi• Câyc ăn gia c…n trongntt• Giao•un nhnh thông quatng trongnhmmu donh sau:mm nt không y .u y o ra giaon ngt dinng cây.mm nhai không y .u y onh giaonc nhaunhưng ng p .11nh đaanhĐa•icn (allopolyploidy)nhnh dotăng hayuNSTc nhaugen a ci hay c chic nhau)c onh do laia cic nhau i sauNSTc nhân đôi.cgenc nhaungcu nginhoa (AABBDD…).Đa icn n i trongnhiênt cơo raii.Đa icnu c cao hơn đa ingn. Tuy nhiên,u cnh n nh ađa inhân oc octương ngNSTa cgen a ci.P: 2n•••••••ng đaicng NSTb bGaTăngi NSTa TB sinhng (1)nbnTăngi NSTa TB sinhng (1)a b(1)ng nguyêniiAa a a aGngdo tăngo sinhnga a(•ia anguyênia a b b2nxng nguyêniiBb b b bb b2nnTạo ra các loài cây trồng mớiKhắc phục cản trở khi lai xaPhục hồi hữu dục ở con lai xaTăng khả năng kháng sâu bệnh và điềukiện bất lợi.Hình 5.17. Những con đường chủ yếu hình thành đa bội3.3 Đơn bội thểTạo đơn bội thể• Ý nghĩa:- Sử dụng đơn bội thể có thể rút ngắn nhanh quátrình đồng hợp tử hóa bằng cách chuyển từ đơnbội sang đơn bội kép- Cây đơn bội biểu hiện tất cả các thông tin ditruyền ra kiểu hình nên dễ dàng nhận biết cácalen lặn, khả năng kháng các điều kiện bất lợi...- Có thể phát hiện đột biến ở cây đơn bội, nhữngđột biến không thể truyền qua giai đoạn phôi• Các quá trình sau có thể dẫn đến tạo cây đơnbội trong điều kiện in vivo- Mẫu sinh (thụ tinh giả): tế bào đơn bội của túiphôi phát triển thành bào tử thể.- Phụ sinh: quá trình thụ tinh bình thường nhưngtế bào trứng có nguồn gốc từ bộ gen cây mẹ bịnhân bố đẩy ra ngoài và nhân bố gắn vào tế bàochất mẹ rồi phát triển thành bào tử thể đơn bội- Loại trừ NST: Loại trừ hoàn toàn bộ gen của 1trong 2 bố mẹ ở con lai sẽ dẫn đến đơn bội12Phương pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôicấy bao phấn• Tạo đơn bội thể trong điều kiện in vitro:- Nuôi cấy bầu và noãn không thụ tinh.- Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.Các bước nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội:• Bước 1: Lựa chọn kiểu gen• Bước 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn• Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy• Bước 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản• Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây• Bước 6: Chuyển cây ra giá thể, ngoài đất vàđánh giá chọn lọc dòng.Phương pháp nuôi cấy bao phấnchú ýPhương pháp 2: tạo đơn bội bằngkích tạo đơn bội tự nhiên• Khử trùng bao phấn non rồi đưa vào môitrường nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp(280C).• Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy baophấn như: điều kiện xử lý mẫu, môitrường nuôi cấy, kiểu gen của vật liệu...• Phương pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còngọi là phương pháp tạo đơn bội kép (DH) invivo. Geiger (2009) trong cuốn sách chọn tạogiống ngô (Nhà xuất bản Springer, New York)đã thông báo rằng nếu thụ phấn các cây ngô cókiểu gen đặc thù gọi là cây kích tạo (inducer),cây nhận phấn tạo ra một tỉ lệ hạt nhất định cóphôi đơn bội (haploid embryo) và nội nhũ tambội. Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòngthuần trong tạo giống ngô lai thương mại.* Lưỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép(DH):Phương pháp lưỡng bội hóa cây đơn bội từ nuôicấy bao phấn hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổbiến nhất là sử dụng colchicine (Gayen và cs.,1994; Deimling và cs., 1997; Eder và Chalyk,2002). Chất alkaloid này hoạt động cản trở quátrình phân chia tế bào và dẫn đến không giảmsố lượng nhiễm sắc thể khi phân chia.Colchicine có tính độc cao, ngày nay có thể sửdụng một số chất khác thay thế là thuốc trừ cỏ,pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxidegas (Kato, 2002), nhưng những chất thay thếnày không phù hợp xử lý một số lượng lớn.Hình 5.20. Các bước tạo dòng DH ở ngô băng Phương pháp in vivo(Nguồn Andrés Gordillo và cs., 2010)134 Tạo biến dị bằng công nghệ tế bào4.1 Nguồn gốc của các biến dị tế bào somaa. Những thay đổi di truyền xảy ra trước khi nuôi cấymô in vitro:Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoácủa mô và tế bào một số các thay đổi di truyền đã xảyra và được tích luỹ trong các tế bào soma (D'amato,1985). Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây được tái sinh từtế bào soma sẽ là các đột biến. Các nhà khoa họcđưa ra khái niệm automutagenesis - tự đột biến (độtbiến xảy ra không do các tác nhân từ bên ngoài gâynên hay là đột biến tự nó - automuctagenesis).4.2 Các hướng ứng dụng của hiện tượng biến dị tế bàosômaNhư đã phân tích ở trên, việc gây tạo và chọn lọc các độtbiến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy in vitro có nhiềuứng dụng đa dạng:- Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất cácchất hoạt tính sinh học với năng suất cao (xem côngnghệ bioreactor)- Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dịquý, ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạođược giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ donấm Fusarium gây ra. ở nước ta, Viện Công nghệ sinhhọc đã tạo được giống lúa mới DR2 có khả năng chịuhạn, chịu lạnh bằng phương pháp chọn lọc các biến dị tếbào soma in vitro từ một giống lúa không có khả năngchống chịu. Giống này đã được công nhận là giống quốcgia.5.1. Các phương pháp chuyển gen5.1.1 Chuyển gen trực tiếpLà phương pháp chuyển trực tiếp các gen đãđược thiết kế trong plasmid vào tế bào thực vậtcó sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tácnhân cơ giới. Chuyển gen trực tiếp thông quamột số kỹ thuật saua. Chuyển gen bằng xung điệnb. Chuyển gen nhờ xử lý PEG (polyethyleneglycon)c. Chuyển gen bằng vi tiêmd. Chuyển gen bằng súng bắn genb. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quátrình in vitro:Một nguồn biến dị tế bào soma quan trọng là thayđổi trong bộ máy di truyền xảy ra khi nuôi cấytạo mô sẹo và phân hoá cơ quan in vitro.Chroqui và Bercetch (1985) cho biết auxin gây rađa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy(endopolyploidization).Oono (1982) nuôi cấy mô sẹo từ hạt lúa và tái sinhcây từ mô sẹo cho biết BAP có nồng độ 30 mg/ltạo ra tần số đột biến lớn gấp 50 lần so với BAPở nồng độ 2 mg/l.5. Tạo biến dị bằng công nghệ gen(chuyển gen)• Chuyển gen là một công cụ mới bổ sungcho chọn tạo giống truyền thống và có thểgiúp cho việc mở rộng các nguồn gen cólợi từ các loài khác chuyển sang các loàicây trồng mong muốn. Công nghệ chuyểngen có lợi thế là có thể chuyển một genđơn hoặc gen số lượng mà phương pháptruyền thống rất khó thực hiện.5.1.2 Chuyển gen gián tiếpPhương pháp chuyển gen gián tiếp là genđược chuyển vào tế bào thực vật quamột sinh vật trung gian, thường là vi sinhvật hoặc virus.a. Chuyển gen nhờ virusb. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens14Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens• Cơ sở của phương pháp này dựa trên hiện tượng nhómvi khuẩn Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thựcvật gọi là Ti-plasmid như mô tả trong hình• Bước 6: bên trong tế bào chất của tế bào ký chủT-DNA tồn tại một chút T-complex thành thục,phân tử T-strand có độ dài hoàn chỉnh với vỏ làmột số phân tử VirE2. Những phân tử này là TDNA cấu trúc và protein cần thiết cho vậnchuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, đây làbước chính trong quá trình biến nạp di truyền;• Bước 7: thâm nhập vào nhân;• Bước 8: vận chuyển trong nhân;• Bước 9: T- DNA không vỏ bọc;• Bước 10: hòa hợp với di truyền ký chủ.Cơ chế quá trình vi khuẩn chuyểngen vào tế bào• Bước 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật;• Bước 2 và 3: kích thích sự biểu hiện của vùngvir bằng tín hiệu đặc thù của ký chủ;• Bước 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổhợp hoạt động của protein VirD1 và VirD2;• Bước 5: tế bào vi khuẩn tồn tại T-DNA như mộtphức hợp protein ADN với một phân tử VirD2gắn ở đầu 5’ của T-strand và có một số proteinvir khác chuyển vào tế bào ký chủ bằng hệthống VirB/D4, mỗi bước yêu cầu có tương táccủa T-pilus với 1 protein đặc thù của ký chủ;Các bước chuyển gen nhờ vi khuẩn• Bước 1: Tách và nhân vi khuẩn• Bước 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti plamid của vi khuẩn• Bước 3: Tách mô chuyển gen• Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn đã gắnplamid vào mô tế bào• Bước 5: Tái sinh cây chuyển gen• Bước 6: Đánh giá cây chuyển gen15