Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcNội dung1. Lịch sử nghiên cứu1.1 Trên thế giớiNăm 1890, thí nghiệm đầu tiên về cấy truyền phôi thành công trên thỏ bởiWalter Heap. Ông là người sáng lập ra công nghệ cấy truyền phôi.- 1932, cấy truyền phôi thành công trên dê bởi Warwick và Berry.- 1933, cấy truyền phôi thành công trên chuột cống bởi Nicholas.- 1934, cấy truyền phôi thành công trên cừu bởi Warwick và Berry.- 1951, bê đầu tiên trên thế giới ra đời bằng cấy truyền phôi bởi Willet và-cộng sự.1970, thành công trong công việc bảo quản phôi đông lạnh.1972, cấy truyền phôi trên bò bởi Willmut và Rowson.1982, vi phẫu thuật thành công trong phòng thí nghiệm [theo Vlahov,-1987].1992, bằng kĩ thuật cloning từ một phôi bò đã cho ra 5 phôi [Viện INRAPháp, 1992].Nhóm 21Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc1.2 Ở Việt Nam- Năm 1978, trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia đã có một bộphận bắt đầu nghiên cứu cấy truyền phôi thỏ.- Năm 1980, nghiên cứu cấy truyền phôi bò. Tháng 9-1989, Viện chăn nuôi bộmôn cấy truyền phôi được thành lập.- Năm 1986, Con bê đầu tiên ở nước ta ra đời từ cấy truyền phôi.- Năm 1989, Cấy truyền 50 phôi đông lạnh với sự giúp đỡ của 2 chuyên giaCuba.- Năm 1996, 150 phôi đông lạnh cấy trên bò miền Nam và Hà Nội, những bêsinh ra sinh trưởng, phát triển, sinh sản bình thường, cho sữa vượt toàn đàn 2030%.Hình 2: Bò được chuyển phôi ở Việt Nam.Nhóm 22Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc2. Cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn2.1 Cơ sở khoa học- Phôi có thể coi là 1 cơ thể độc lập ở giai đoạn đầu của quá trình phát triển.- Nếu chuyển phôi vào cơ thể khác có trạng thái sinh lí sinh dục phù hợp vớitrạng thái của cá thể cho phôi thì nó vẫn sống và phát triển bình thường [ sự phùhợp đó gọi là sự đồng pha].- Sử dụng các chế phẩm sinh học chứa hoocmon có thể điều khiển sinh sản củavật nuôi theo ý muốn.2.2 Ý nghĩa thực tiễn- Tăng số đời con của những bò cái có tiềm năng di truyền vượt trội, phổ biến vànhân nhanh các giống tốt, quí, hiếm ra thực tế sản xuất trên cơ sỏ khai thác triệtđể tiềm năng di truyền của những cá thể cái cao sản cho trứng và cá thể đực cho-tinh trùng, tận dụng tốt đặc tính của cả con cho và nhận phôi.Nâng cao khả năng sinh sản, các sản phẩm thịt, sữa trong chăn nuôi bò.Tăng tốc độ kiểm tra đời sau, nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh công tác-giống trên cơ sở tăng nhanh tiến độ di truyền hằng năm.Giảm khoảng cách thế hệ.Giúp con người dễ dàng, thuận lợi trong việc xuất nhập, vận chuyển phôi từ khuvực này sang khu vực khác, tránh lây lan bệnh tật, tiết kiệm chi phí kiểm dịch,-hạn chế stress và chi phí vận chuyển gia súc sống.Tạo bê sinh đôi thúc đẩy nhanh sự phát triển của các ngành khoa học khác như:-sinh lý, di truyền học.Có thể tạo phôi từ những con bò cái có tiềm năng di truyền cao nhưng không cókhả năng duy trì quá trình mang thai bình thường. Bảo tồn con giống dưới dạng-trứng, phôi, tinh trùng nhằm giữ vật liệu di truyền.Hạn chế một số dịch bệnh và nâng cao khả năng chống chịu bệnh, khả năng thíchnghi cho con vật ở môi trường mới [không lây truyền bệnh, tăng sức đề kháng…].3. Quy trình cấy truyền phôi bò nhân tạoSơ đồ quy trình:Chọn bò cho phôi và gâyđộng dụcNhóm 23BòThụchotinhphôinhântrở lạiGây Thurụnghoạchtrứng phôinhiều ởbìnhtạothườngbò cho phôiChọn bò nhậnphôiĐàn con sinh ra mang đặc tínhdi Cấytruyềncủa bòchophôitruyềnphôivàoGây độngBò nhậndụcphôicho bòbò nhận phôinhậncó chửaphôiCông nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcNhóm 24Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc3.1] Chọn bò cho trứng và gây động dục- Bò khỏe mạnh, không có bệnh tật về đường sinh sản, có năng suất cao 50007000kg sữa/ 1 chu kỳ.- Bò cái năng suất cao về một hoặc một vài tính trạng mong muốn và các tínhtrạng đó phải được di truyền cho thế hệ sau. Ưu tiên những tính trạng có hệ số ditruyền cao và giá trị thương phẩm lớn.- Không mắc khuyết tật hoặc bệnh di truyền nào- Không quá già- Chu kì động dục bình thường, biểu hiện chu kì rõ ràng. Buồng trứng hoạtđộng tốt. Chọn bò sau khi sinh con từ 2 tháng đến 5 tháng.3.2] Gây rụng trứng nhiều ở bò cho trứng- Đưa hoocmon PMSG vào bò bằng dụng cụ chuyên dụng [Kill made]. Mụcđích: đưa một lượng hoocmon PMSG cao vào trong máu của bò nhằm ức chếtoàn bộ quá trình phát triển nang trứng của bò.- Sau 5 ngày, tiếp tục tiêm hoocmon estradiol, lượng tiêm 0,5ml liều là 1mg.tiêm vào bắp sau mông bò.- Ngày 10 và 13 rút kill made và tiêm FSH để thúc đẩy quá trình tạo nangtrứng phát triển đồng loạt sau một thời gian bị ức chế và rụng một lượng lớntrứng.[ tính từ ngày đưa kill made vào đường sinh dục bò].Hình 3: Kill made và đưa hoocmon vào bòNhóm 25Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc3.3 Thụ tinh3.3.1 Thu trứng.Hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu li tâm dùng trong kĩ thuật hỗ trợ sinhsản ở người. Phương pháp OPU đòi hỏi phải có các thiết bị và dụng cụ chuyêndụng như máy siêu âm, đầu dò, kim chọc hút cũng như tay nghề cao của ngườithao tác. Hệ kim hút có nối dây để thu trứng từ nang vào tube đựng bên ngoài. Bộđầu dò siêu âm và dây chuyền tín hiệu. Phần nhựa cố định đầu dò. Ống kim loạibao ngoài toàn bộ hệ thống kim, dây hút, đầu dò, dây truyền tín hiệu. Phươngpháp này cho phép hút các trứng trong nang trứng của buồng trứng từ con vậtđang sống. Con vật đưa vào khai thác trứng được giữ đứng yên trong giá cố địnhvà người thao tác một tay đưa vào trực tràng kiểm soát buồng trứng, áp buồngtrứng vào đầu dò, tay kia điều khiển kim hút.- Cách tiến hành: Cho bò vào giá cố định, lấy hết phân ra, rửa sạch, sát khuẩn âmhộ và khu vực xung quanh.- Chuẩn bị hệ thống máy siêu âm, nối đầu dò âm đạo vào máy siêu âm. Nối kimhút tế bào trứng [kim 16G dài 55 cm], đặt máy tạo áp suất ở 120 mmHg, tươngđương tốc độ dòng chảy 25 ml/phút. Chuẩn bị môi trường hút tế bào trứngNhóm 26Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc[mDPBS của Sigma] có bổ sung 50 iu/ml heparin và 5% huyết thanh bê và khángsinh [100.000 UI penicilin/ml + 100mg streptomycin/ml] duy trì ở nhiệt độ 37oCbằng máy ổn nhiệt.- Nhẹ nhàng cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tayqua trực tràng xác định vị trí của buồng trứng, vị trí các nang trứng rồi đưa buồngtrứng về phía đầu quét của đầu dò, quan sát các nang trứng trên màn hình máysiêu âm, đếm số nang trứng có mặt trên buồng trứng. Trước khi hút dịch nangtrứng, hút một ít môi trường hút trứng để làm trơn hệ thống kim và ống dẫn. Saukhi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bàotrứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nangtrứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện. Dịch hút đượcthu vào ống ly tâm 50ml và duy trì ở nhiệt độ 370C bằng máy ổn nhiệt.- Sau khi hút xong một buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốclọc Emcon có đường kính lỗ lọc 20µm, 10ml dung dịch còn lại được chuyển vàođĩa petri vô trùng có đường kính 90mm để soi tìm tế bào trứng dưới kính hiển visoi nổi. Tế bào trứng thu được được đánh giá.Nhóm 27Công nghệ sinh học động vật-GVHD: Nguyễn Thị Kim CúcPhân loại và chọn lọc tế bào trứng+ Loại A: tế bào trứng hoàn hảo, trứng có trên 4 lớp tế bào cumulus chắc, dày baoquanh vòng trong suốt tròn rõ, liên kết chặt với nhau, chất nguyên sinh đồng đều.+ Loại B: tế bào trứng với ít hơn 4 lớp tế bào cumulus, không liên kết chặt chẽ, cómột vài nơi bị mất các tế bào này, nguyên sinh chất đồng đều nhưng màu hơi tối.+ Loại C: không có lớp tế bào cumulus bao quanh tế bào trứng mà chỉ có các sợihuyết [fibrin], nguyên sinh chất không đồng đều.Thông thường chỉ dùng trứng loại A và B để nuôi tới chín sau đó thụ tinh thànhhợp tử để phát triển thành phôi.-Nuôi chín tế bào trứngCác trứng khai thác từ buồng trứng đều ở trạng thái chưa thành thục, để có thểđược thụ tinh , trứng cần có khả năng phát triển và đạt đến trạng thái thành thục.Sự phát triển của trứng như vậy có kèm theo những biến đổi về mặt hình thái,sinh lý và sinh hóa liên quan đến nhân trứng, nguyên sinh chất và màng trứng.Chọn những trứng có chất lượng tốt đưa vào nuôi cấy trong môi trường TCM-1995% CS [20 tế bào trứng trong 100 ml môi trường] với sự có mặt của những tế bàogranulose [ở nồng độ 1-5 triệu tế bào/ml]. Nhiệt độ tử nuôi được đặt ở 38,5oC,đồng thời nồng độ sục khí CO2 được điều chỉnh ở mức 5%.Môi trường nuôi được bổ sung bằng huyết thanh bò đang động dục [giàu LH,FSH, Estradiol] hoặc bằng huyết thanh bào thai [giàu yếu tố IGF-1] và song songcũng bổ sung thêm Estradiol- 17β [nồng độ cao có ảnh hưởng âm tính tới sự hìnhthành thoi vô sắc cũng như sự xuất hiện thể cực đầu tiên]. Tuy nhiên, để hoànthiện quá trình thành thục trong ống nghiệm, vẫn cần bổ sung thêm LH, FSH vàomôi trường nuôi trứng.Nhóm 28Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc3.3.2] Hoạt hóa tinh trùng* Thu tinh trùng: tinh trùng được thu từ bò đực giống với những đặc điểm nhưsức khỏe tốt, có những tính trạng tốt như mong muốn, không mắc bệnh ditruyền,...Thu tinh trùng bằng phương pháp nhảy giả: Tinh trùng được thu trực tiếpbằng cách cho bò đực nhảy vào giá nhảy giả làm bằng hình nộm bò cái có gắn âmđạo giả. Bò đực sau khi được dắt đến giá nhảy nhờ phản xạ có điều kiện bò đựcnhảy giả và xuất tinh vào âm đạo giả, thu nhận tinh trùng từ âm đạo giả, giữ trongmôi trường INRA sau đó đem đi bảo quản lạnh trong nitơ lỏng -1960c.* Tinh trùng được hoạt hoá theo phương pháp 90% percoll:- Ly tâm lần 1: lấy 3 ml môi trường 90% percoll cho vào ống ly tâm, giải đông 12 cọng rạ tinh đông lạnh trong nước ấm 37°C, cho tinh trùng vào ống ly tâm đã cómôi trường 90% percoll, ly tâm với tốc độ 2100v/phút trong 10 phút- Ly tâm lần 2: Lấy phần tinh trùng lắng phía dưới, cho tiếp 6ml môi trường rửatinh trùng [BO+ Hypotaurine+ Heparin], ly tâm lần 2 [1800v/phút, trong 5 phút].- Pha loãng đến nồng độ là 6,25x106 tinh trùng/ml.Nhóm 29Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcNhóm 210Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc3.3.3] Thụ tinh- Tế bào trứng sau khi nuôi 20 giờ lấy ra khỏi tủ nuôi cấy, rửa 3-4 lần trongmôi trường rửa [BO + BSA]. Sau đó để tiến hành thụ tinh, chuyển 20 TB trứng đãrửa vào 100μl môi trường BO có mật độ tinh trùng 6,25x10 6 tinh trùng / ml trongđĩa petri có phủ dầu khoáng vô trùng, cho vào tủ nuôi cấy 5% CO 2 , nhiệt độ38,5ºC, độ ẩm 98%, quá trình thụ tinh được tiến hành trong khoảng thời gian 5-6giờ.- Thu trứng đã thụ tinh từ các giọt chứa tinh trùng [giọt môi trường thụ tinh].- Rửa trứng đã thụ tinh 3 lần trong môi trường nuôi trứng chín [TCM-199] đãchuẩn bị sẵn.- Đặt đĩa đã có trứng thụ tinh vào tủ ấm có nhiệt độ 38 0C với 5% C02 trong48h.Hình 7: Trứng đã thụ tinh3.3.4] Nuôi phôi- Chuẩn bị hai đĩa rửa, mỗi đĩa 2,5ml môi trường CR1aa 5% CS, phủ 2 ml dầukhoáng vi lượng. Một đĩa nuôi phôi: lấy 4 giọt mỗi giọt 100 ml CR1aa 5% CScho vào đĩa petri, phủ 4,5 ml dầu khoáng vi lượng. Cho cả 3 đĩa trên vào tủ ấmNhóm 211Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcCO2 khoảng 2 giờ trước khi chuyển phôi vào nuôi. Trứng sau khi thụ tinh, đượcchuyển vào đĩa rửa, rửa ở mỗi đĩa 3 lần, sau đó chuyển vào giọt môi trường nuôiphôi, cho vào tủ nuôi cấy CO2 nuôi tiếp và theo dõi sự phát triển của phôi. Sựphân chia của hợp tử được đánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 48 giờ sau thụtinh. Sự phát triển của phôi được đánh giá bằng kính hiển vi soi nổi ở ngày thứ 5,6, 7 sau khi nuôi cấy trong ống nghiệm dựa vào số phôi phát triển đến giai đoạnphôi dâu, phôi nang. Ngày 0-2: phôi phát triển 1 tế bào, ngày 1-3: phôi 2 tế bào,ngày 2-3: phôi 4 tế bào, ngày 3-5: phôi 8 tế bào, ngày 5-6: phôi dâu, ngày 6-7:phôi dâu chặt, ngày 6-8: phôi nang sớm, ngày 8-9: phôi nang trương nở hoặcđang thoát màng, ngày 9-11: phôi nang thoát màng.3.4] Thu phôi, chọn lọc phôi- Sau khi thụ tinh, loại bỏ trứng không thụ tinh. Trứng không thụ tinh màngnoãn hoàn hiện rõ nét, nhân có cấu trúc đồng nhất không có sự phân chia.- Trứng thụ tinh: có sự phân chia tế bào và tương ứng với các giai đoạn pháttriển của phôi.- Phôi kém chất lượng là những phôi chậm phát triển, phôi thoái hóa.Nhóm 212Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc- Phôi có chất lượng tốt là phôi dâu, phôi nang có hình dáng và kích thước phùhợp với độ tuổi, màu sắc của tế bào đặc trưng.Nhóm 213Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc3.5] Chọn bò nhận phôi và gây động dục đồng pha bò nhận phôi- Bò khỏe mạnh, không có bệnh tật về đường sinh sản, sinh sản tốt tạo tỷ lệ đậuphôi cao khi đưa phôi vào cơ thể, không cần năng suất cao.- Bò cái nhận phôi không đóng góp về kiểu di truyền của con nhưng có tácđộng đến kiểu hình của con non trong thời gian mang thai và nuôi con.- Sự đồng pha: trạng thái sinh lý sinh dục của bò nhận phôi phù hợp với trạngthái sinh lý sinh dục của bò cho phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi.- Gây động dục đồng pha là quá trình kích thích cho cái nhận phôi động dụcđúng vào thời điểm động dục của cái cho phôi.3.6] Cấy truyền phôi [ET- embryo transfer]- Là quá trình đưa phôi được tạo ra từ cá thể bò mẹ cho phôi vào cá thể bò mẹkhác [Bò nhận phôi]. Phôi vẫn sống và phát triển bình thường trên cơ sở trạngthái sinh lí sinh dục của bò cho phôi phù hợp với bò nhận phôi hoặc phù hợp vớituổi phôi, sự phù hợp này gọi là đồng pha.- Dùng phương pháp cấy truyền phôi bằng cọng rạ để cấy truyền phôi vào bònhận.Nhóm 214Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc3.7] Kiểm tra, chăm sóc bò mang thaia. Chăm sóc bò mang thaiThức ăn chủ yếu là cỏ xanh, phụ phế phẩm trồng trọt và công nghiệp nhưrơm, vỏ thân cây bắp, đọt mía, thân các loại cây họ đậu, cám, rỉ mật …Bò cái chửa cần được ăn uống đầy đủ, mỗi ngày 30-35 kg cỏ tươi, 2 kgrơm ủ, 1 kg thức ăn tinh [ngô, cám,…], 25- 30 gram muối, 30-40 gram bộtxương. Không bắt bò làm những việc nặng như: cày bừa, kéo xe,… Tránh xuađuổi mạnh đối với bò đang có chửa tháng thứ 3, tháng thứ 7, thứ 8 và thứ 9.b. Đỡ đẻ cho bòThời gian mang thai trung bình của bò là 280-285 ngày.- Triệu chứng bò sắp đẻ: Bò có hiện tượng sụt mông, bầu vú căng, đầu vúchĩa về hai bên, niêm dịch treo lòng thòng ở mép âm môn, đau bụng, đứng lênnằm xuống, chân cào đất, đái nhiều lần, khi bắt đầu đẻ bọc ối thò ra ngoài trước.- Đỡ đẻ cho bò: Trong trường hợp bò đẻ bình thường [thai thuận] khôngcần can thiệp hoặc chỉ cần hỗ trợ cho bò cái bằng cách dùng tay kéo nhẹ thai ra.Cắt dây rốn dài khoảng 10-12 cm [không cần buộc dây rốn], sát trùng bằng cồnIốt 5%. Lau rớt, rãi trong mũi, mồm bê, để bò mẹ tự liếm con. Vệ sinh phần thânsau và bầu vú bò mẹ, cho bò mẹ uống nước thêm ít muối, cám và nước ấm.Trường hợp đẻ khó phải gọi cán bộ thú y can thiệp kịp thời.c. Chăm sóc, nuôi dưỡng bò đẻ và bê con* Đối với bò mẹ- 15- 20 ngày đầu sau khi đẻ cho bò mẹ ăn cháo [1,0- 1,5 kg thức ăntinh/con/ngày] và 25-30 gr muối ăn, 30-40 gr bột xương, có đủ cỏ non xanh ăn tạichuồng.- Những ngày sau, trong suốt thời gian nuôi con, một ngày cho bò mẹ ăn30 kg cỏ tươi, 2-3 kg rơm ủ, 1-2 kg cám hoặc thức ăn hỗn hợp để bò mẹ phục hồisức khoẻ, nhanh động dục lại để phối giống.* Đối với bêNhóm 215Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc- Từ khi sinh ra đến 30 ngày tuổi bê được nuôi ở nhà, cạnh bò mẹ. Luôngiữ ấm cho bê, tránh gió lùa, chỗ bê nằm khô, sạch.- Trên 1 tháng tuổi, chăn thả theo bò mẹ ở bãi gần chuồng, tập cho bê ănthức ăn tinh.- Từ 3-6 tháng tuổi: cho 5-10 kg cỏ tươi và 0,2 kg thức ăn tinh hỗn hợp.Tập cho bê ăn cỏ khô. Nên cai sữa bê vào khoảng 6 tháng tuổi.- Từ 6-24 tháng tuổi, chăn thả là chính, mỗi ngày cho ăn thêm 10-20 kg cỏtươi, ngọn mía, cây ngô non. Mùa thiếu cỏ có thể cho ăn thêm 2-4 kg cỏ khô mộtngày.3.8] Đàn bê năng suất cao được sinh ra.Nhóm 216Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcHình 8: Bò cấy truyền phôi sinh trưởng và phát triển tốt.Nhóm 217Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcDanh mục thành phần các loại môi trường1. Môi trường nuôi thành thục trứng: TCM- 199PVA [mg]Sodium citrate [0,5mM] [ml]Axit amin thay thế [x100] [ml]Yếu tố sinh trưởng biểu bì [EGF][mg]Penicillin [iu]Streptomycin [mg]pHÁp suất thẩm thấu [mOsm]Nuôi thành thục trứng[trong 100ml M199]300-Nuôi hợp tử [trong100ml mSOF]3001,01,01,00,5500057,3-7,4290-310500057,4270-2802. BSA: là abumin huyết thanh bò . albumin là protein phổ biến nhất trong hệ tuầnhoàn và chiếm 80% áp suất keo của máu. Người ta chứng minh rằng albuminhuyết thanh chịu trách nhiệm chính cho việc duy trì pH máu. Albumin động vậtcó vú được gan tổng hợp ban đầu ở dạng preproabumin. Sau khi loại bỏ chuỗipeptide tín hiệu thành proalbumin và tiếp tục loại bỏ 6 proalbumin còn lại để trởthành albumin.Albumin được cấu tạo bởi lượng thấp tryptophan, methionine; lượng lớn cytinevà những amino acid tích điện, aspartic, glutamic acid, lysine, arginine. Glucinevà isoleucine trong BSA thấp hơn so với protein bình thường.3. BSA phản ứng với các protein như lysozyme và clupeine nhờ vào liên kết chéogiữa BSA và lysozyme tại bề mặt phân cách. BSA tiến tới điểm đẳng điện khi lựcđẩy tĩnh điện ở mức tối thiểu. Khi nó tương tác với lysozyme, sự giãn nở và ổnđịnh lớn nhất ở pH 8 và 9 cải thiện việc tạo bọt và ổn định pH, chất vận chuyểnnhững acid béo không no trong huyết thanh. Nó cũng thực hiện các chức năngkhác như cô lập các gốc oxygen tự do và bất hoạt các độc tố như bilirubin.BSA làm tăng amino acid được bổ sung, cung cấp những phân tử không phảiamino acid được kết hợp kích thích sự phất triển, cung cấp những chất bắt giữ.4. Dung dịch đệm Dulbecco - PBS*Nhóm 218Công nghệ sinh học động vậtThành phần1 Sodium chlorideGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcCông thứcgNaCl8,000,202 Potasium chloride KClSodium dihydrogen3NaH2P04.2H20 1,15OrthophosphateDisodium hydrogen4Na2HP04.2H20 0,20Orthophosphate5 Glucose6 Sodium pyruvateC6H12061,00Thành phầnCông thức g7CalciumchlorideCaCl2.2H20 0,1328MagnesiumsulphateMgS04.7H20Lyopholized 9 BSA0,400Penicilin G.10 Sodium**110,036 12Streptomicinsulphate0,05Nước cất 2 lầnvừa đủ**** Lọc thanh trùng bằng màng vi lọc 0,2 ** 100UI/ml; ***1000ml0,4 m;5. D-PBS [Môi trường thu nhận trứng]Thành phầnHàm lượngNaCl8gKCl0,2 gKH2PO40,2 gNa2HPO4.12H2O1,15 gMgCl2.6H2O0,1 gCaCl20,1 gNa pyruvate0,036 gNhóm 2190,121Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcGlucose1gBSA [Sigma]3-4gNước cất 2 lầnVừa đủ 1000 ml6. Dung dịch phá cumulus [Hyaluronidase 1,0 mg/ml]Thành phầnHàm lượngHyaluronidase [Sigma]10 mgPBS [-]Vừa đủ 10 ml7. Dung dịch pha loãng tinh trùngThành phầnHàm lượngNaHCO3 5%50 gFormol 36-40%10 mlTrypan Blue0,25 gNước cấtVừa đủ 1000 ml8. Môi trường IVFThành phầnHàm lượngTCM-1999,78 g/lD-glucose3,05 mMNhóm 220Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcCalcium lactate2,92 mMSodium pyruvate0,91 mMPotassium penicillin G75 µg/ mlStreptomycin sulfate50 µg/mlFetal calf serum10 %9. Môi trường CR1aa [dùng nuôi phôi sau khi thụ tinh].a. CR1aa- A:Thành phầnHàm lượngNaCl6.7031 gKCl0.2311 gNatri pyruvate0.044 gNaHCO32.2011 gPhenol red [10 µg/ml]0.01Nước cất 2 lần vừa đủ770 mlb. CR1aa- B:Thành phầnHàm lượngHemicalcium lactate0.5996 gNhóm 221Công nghệ sinh học động vậtNước cất 2 lần thêm vừa đủGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc200 mlc. Môi trường CR1aa:Thành phầnHàm lượngCR1aa- A77 mlCR1aa- B20 mlBME [Essential Amino Acid] 100X1 mlMEM [Non Essential Amino Acid] 100X 1 mlL- Glutamic acid[20 mg/ml]1 mlBovine Serum Albumine 3 mg/mlPenicillin- G 100IU/ml10000 IUStreptomycin Sulfate 100µg/ml10010. Môi trường nuôi trứng chínTCM-199 bổ sung 20% FBSNhóm 222Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcThành phầnHàm lượngTCM-199 [Sigma]80 mlFBS [GIBCO]20 mlGentamycin0,125 mlTCM-199 bổ sung 3 mg/ml BSAThành phầnHóa chấtTCM-199 [Sigma]100 mlBSA [Sigma]300 mgGentamycin0,125 ml11. Môi trường nuôi trứng In Vitro TCM- 199 + 20% FBSThành phầnHàm lượngTCM- 19919.5 mlFBS5 mlGentamycin62.5 µlNatri pyruvate0.5 mlNhóm 223Công nghệ sinh học động vậtFolltropinGVHD: Nguyễn Thị Kim Cúc125 µlNhóm 224Công nghệ sinh học động vậtGVHD: Nguyễn Thị Kim CúcTài liệu tham khảo-Giáo trình công nghệ sinh học động vật. Nguyễn Thị Kim Cúc.//doc.edu.vn/tai-lieu/giao-trinh-sinh-ly-hoc-vat-nuoi-sinh-ly-sinh-san68717/.//luanvan.co/luan-van/san-xuat-phoi-bo-bang-thu-tinh-ong-nghiemtheo-phuong-phap-imai-40445/ sản xuất phôi bò//nghenong.com/video/ki-thuat-truyen-cay-phoi-cho-bo-sua-kenh-nhanong-4422.html quy trình cấy truyền phôi ở bò.//www.authorstream.com/Presentation/anhnongdan-1109645-congnghe-cay-truyen-phoi-bo-nxpowerlite/ kỹ thuật cấy truyền phôi//tailieu.vn/doc/bai-giang-cong-nghe-cay-truyen-phoi-bo1743097.html bài giảng cấy truyền phôi.//vcn.vnn.vn/thu-tinh-trong-ong-nghiem-in-vitrofertilization_n58151_g721.aspx//doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-anh-huong-cua-nong-do-bsa-bovineserum-albumin-trong-moi-truong-nuoi-cay-len-kha-nang-phat-trien-cuaphoi-10020/.Nhóm 225