Một số lưu ý khi sử dụng Ethidium bromide

BioMedia

Điện di trên gel polyacrylamide – Natri dodecyl sulfate (SDS-PAGE). Hệ thống điện di trên gel natri dodecyl sulfate (Sodium Dodecyl Sulfate – SDS) được sử dụng để xác định số lượng và kích thước của chuỗi protein hoặc các chuổi tiểu đơn vị protein trong việc phân tách protein. Ban đầu quá trình chuẩn bị protein được xử lý với một lượng dư thiol hòa tan (thường là 2-mercaptoethanol) và SDS. Dưới những điều kiện này, thiol làm giảm tất cả các liên kết disulfide (-S-S-) có mặt bên trong hoặc ở giữa các đơn vị peptide, trong khi SDS (chất tẩy rửa ion hoặc biến tính) liên kết với tất cả các khu vực của protein và phá vỡ hầu hết các liên kết không phải liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử và tương tác của nội phân tử protein. Hai thành phần này dẫn đến kết quả là toàn bộ protein trong mẫu bị biến tính, tháo cuộn và tính anion cao (điện tích âm) của chuỗi polypeptide (Hình 1).

Hình 1. Gián đoạn protein với sự dư thừa thiol và SDS

Chuỗi anion polypeptide sau đó được điện di trong gel polyacrylamide bão hòa với SDS và hệ đệm mang dòng thích hợp. SDS dư thừa được đưa vào trong gel nhằm duy trì trạng thái biến tính của protein trong quá trình phân tách điện di. Polypeptide được phủ SDS (xấp xỉ 1 phân tử SDS trên 2 acid amino) tạo ra tỷ lệ điện tích trên khối lượng xấp xỉ như nhau cho tất cả các protein. Tại thời điểm này, điện tích nội tại trong chuỗi polypeptide riêng lẻ (có nghĩa là không có mặt SDS) là không đáng kể so với điện tích âm của chúng khi có mặt SDS. Ma sát xuất hiện khi các phân tử di chuyển qua đệm polyacrylamide, bây giờ sẽ là yếu tố chính ảnh hưởng đến độ linh động của phân tử. Ngoài ra sự ma sát của các phân tử trong quá trình phân tách cũng bị chi phối bởi kích thước lỗ rỗng của ma trận polyacrylamide, polypeptide lớn sẽ chịu ma sát lớn hơn các polypeptide nhỏ khi đi qua ma trận polyacrylamide với kích thước đã xác định (các polypeptide cỡ nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn loại cỡ lớn). Tóm lại điện di SDS-PAGE cho phép phân tách protein dựa theo kích thước của chúng.

Nguyên tắc cơ bản của dạng SDS-PAGE thông dụng nhất được minh họa bằng cách mô tả từng bước sự di chuyển của protein trong gel. Quan sát trong hình 2, SDS-PAGE sử dụng hai hệ đệm/ các thành phần gel polyacrylamide trong một phiến duy nhất, được gọi là gel cô “stacking gel” và gel tách (hoặc gel phân giải) “running (resolving) gel”. Mẫu protein đầu tiên được đưa vào giếng đã cho  gel cô sau khi chúng được trộn với bộ đệm nhớt (30% glycerol) có chứa SDS và thiod. Sau khi mẫu đã được nạp, điện áp sẽ được cấp cho hệ thống (với dòng đi qua gel cỡ 3 đến 4 V/cm2) giữa hai bể phân tách của đệm glycine với pH 8.3.

Hình 2. Sự chuyển động protein trong gel cô và gel tách 

Hãy nhớ rằng dòng ion phải tuân theo nguyên lý của phương trình sau:

(*) Độ linh động của phân tử =  

cụ thể là giá trị điện tích lớn sẽ làm tăng tính linh động, trong khi đó kích thước lớn sẽ làm tăng độ ma sát và làm giảm tính linh động. Glycine có điện tích trung bình vào khoảng -0.1 tính cho một phân tử tại pH 8.3 (đệm tách/ đệm glycine) và hầu như không có điện tích âm tại pH 6.8 (pH gel cô). Ngược lại protein được phủ SDS trong hệ thống sẽ mang điện tích âm cao đó là bản chất độc lập của pH trong hệ thống. Tại nồng độ pH yếu trong gel cô, anion glycine bị mất điện tích âm và độ linh động của nó sẽ bị giảm xuống. Ngược lại, ion clorua di chuyển nhanh, sẽ chạy trước các protein vì nó có kích thước nhỏ (ma sát thấp) và có đủ điện tích âm (không bị mất như trường hợp trên). Các protein tích điện âm trong hệ thống có hệ số ma sát lớn do đó chúng di chuyển chậm hơn so với clorua nhưng nhanh hơn các anion glycine gần như không tích điện. Kết quả của độ linh động của các anion này làm cho protein được tích lũy ở phần trước của glycine (Hình 2-b) và sau đó được dồn tập trung tạo thành các băng hẹp tại ranh giới của gel cô và gel tách (Hình 2-c), trong khi đó ion clorua nhanh chóng di chuyển từ trong gel cô vào gel tách.

Khi các anion đi vào trong gel cô thì nồng độ cao của hệ đệm pH 8.8 và nồng độ cao của acrylamide (làm giảm kích thước lỗ) trong gel sẽ kích hoạt hai quá trình. Đầu tiên là nồng độ pH cao của hệ  đệm sẽ truyền điện tích âm cho các ion glycine (các ion này di chuyển rất chậm trong hệ đệm pH 6.8 trong gel cô), vì chúng có khối lượng nhỏ và giờ đây điện tích đã được tăng lên nên các anion glycine nhanh chóng bắt kịp các protein cũng đang chuyển động trong hệ thống. Tỷ lệ điện tích trên khối lượng trở nên bằng nhau trên các protein do sự xuất hiện của SDS trong hệ thống (xem phần trên) do đó sự di chuyển của các protein lúc này sẽ chỉ phụ thuộc vào kích thước của chúng.

Hình 3 chỉ ra độ linh động tương đối của chuỗi anion polypeptide tuân theo hàm logarit khối lượng phân tử của nó. Nếu một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử đã biết được đưa vào mẫu trong quá trình phân tách điện di thì độ linh động tương đối của nó có thể được xác định và được vẽ dưới dạng đồ thị hàm log của khối lượng phân tử và độ linh động tương đối. Khối lượng phân tử của chuỗi polypeptide có thể được ước tính bằng cách thay các giá trị độ linh động đo đạc được của polypeptide chưa xác định vào đồ thị chuẩn thu được từ quá trình phân tích các polypeptide có khối lượng đã biết.

Hình 3. Mối quan hệ giữa trọng lượng phân tử và chuyển động của protein trong gel SDS-PAGE

Có hai phương pháp quan hóa thông dụng nhất thường được sử dụng để quan sát sự phân tách của protein trong SDS-PAGE. Sự lựa chọn giữa hai phương pháp chủ yếu dựa vào độ nhạy được yêu cầu trong ứng dụng. Phương pháp thứ nhất liên quan đến việc làm bão hòa gel trong dung dịch acid axetic, methanol và nước có chứa thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250. Methanol và acid axetic trong dung dịch có tác dụng cố định protein trong chất nền gel còn Coomassie Brilliant Blue liên kết với các protein trong gel. Tương tác giữa thuốc nhuộm Coomassive và protein chủ yếu thông qua lượng dư của arginine mặc dù các tương tác yếu với tryptophan, tyrosine, phenylalanine, histidine và lysine cũng liên quan đến quá trình này. Tiếp đó gel sẽ bị làm mất màu với một dung dịch acid axetic/dung dịch methanol không có chứa thuốc nhuộm (để loại bỏ thuốc nhuộm từ các phần không chứa protein của gel), protein lúc này xuất hiện dưới dạng một băng màu xanh đậm trên gel polyacrylamide. Khi được thực hiên đúng cách phương pháp này đủ nhạy để phát hiện băng protein chỉ bao gồm một lựơng polypeptide rất nhỏ cỡ 0.1 đến 0.5%g. Một phương pháp nhuộm khác là nhuộm bạc, đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể phát hiện 10 ng protein có trong một băng gel crylamide đơn. Nhuộm bạc được bắt đầu cách làm bão hòa gel với dung dịch bạc nitrat, tiếp theo một chất khử sẽ được thêm vào để làm giảm ion Ag+ và kết tủa thành kim loại bạc trên protein trong gel và làm cho các băng protein màu đen xuất hiện trên gel. Nhuộm bạc là một kỹ thuật rất khó do đó nó chỉ được thực hiện khi hiển thị với độ nhạy cực cao.

Đẳng điện hội tụ (Isoelectric Focussing) Đẳng điện hội tụ là một kỹ thuật điện di dùng để phân tách các đại phân tử dựa trên các điểm đẳng điện của nó (các giá trị pI, pH mà tại đó chúng không mang điện tích). Đối với SDS-PAGE quá trình này có thể được thực hiện trong dạng phiến, độ chênh pH được thiết lập trong gel polyacrylamide với sự hỗ trợ của ampholytes là một loại polymer cỡ nhỏ (~5000 Da) có chứa phân bố ngẫu nhiên của các nhóm acid và bazơ yếu (vd, carboxyl, imidazole, amin v.v) Gel polyacrylamide bao gồm những ampholyte này được đưa vào một thiết bị điện di có chứa dung dịch acid loãng (H+) ở anode và bazơ loãng (OH–) ở cathode trong buồng điện di (Hình 4).

Hình 4. Các bước của quy trình điện di đẳng điện

Khi điện áp được cấp cho hệ thống, dòng điện chủ yếu sinh ra do sự di chuyển của các loại ampholyte tích điện xuất hiện ở trong gel. Các ampholyte di chuyển về phía hai cực phù hợp với phân bố điện tích của chúng; các ampholyte với điểm đẳng điện thấp hơn (vd, các loại bao gồm số lượng lớn các nhóm carboxyl và có điện tích âm) sẽ di chuyển về phía anode, trong khi các ampholyte có điểm đẳng điện cao hơn (vd, các ampholyte có nhiều các nhóm amin hơn và có điện tích dương) sẽ di chuyển về phía cathode. Cuối cùng, mỗi ampholyte trong hệ thống sẽ tới vị trí có giá trị pH bằng với điểm đẳng điện của nó trong gel. Khi điều này xảy ra các ampholye lúc này sẽ không có điện tích và chúng không thể tiếp tục di chuyển trong gel. Kết quả của quá trình này là sau một khoảng thời gian điện di thích hợp nồng độ của ampholyte sẽ có vai trò như một hệ đệm cục bộ để thiết lập độ chênh pH ổn định trong gel polyacrylamide. Độ chênh pH này chính là cơ sở để phân tách đại phân tử có sẵn trong hệ thống (hoặc được đưa vào hệ thống sau đó).

Protein ở trong hệ thống hoạt động giống với các ampholyte ở chỗ sự di chuyển phụ thuộc vào điện tích của chúng. Khi các ampholyte thiết lập độ chênh pH trong gel thì các protein trong hệ thống cũng bắt đầu di chuyển về các cực tương ứng đến khi giá trị pH của chúng bằng giá trị pH trong gel, tại đây chúng không mang điện tích âm nữa (pI của protein). Tại điểm này lực tác dụng lên protein gây bởi anode và cathode có giá trị bằng nhau và protein không còn khả năng di chuyển trong hệ thống. Trong thực tế các loại protein khác nhau trong gel sẽ hội tụ tại các vị trí cụ thể trong gel thỏa mãn điều khiện giá trị pH tại ví trí đó bằng giá trị pI của chúng.

Vậy, làm thế nào để xác định quá trình phân tách điện di đã hoàn thành hay chưa? Như đã nói ở trên, quá trình phân tách kết thúc khi giá trị pI của ampholyte và protein đạt tới giá trị pH trong gel khi đó chúng không thể di chuyển được nữa. Khi protein và ampholyte không còn di chuyển thì dòng điện trong hệ thống sẽ giảm xuống một cách đáng kể. Điện di đẳng điện hội tụ được thực hiện với sự có mặt của ampholyte với nồng độ rất thấp (2-4%), nên điện áp cao (150V/cm2) có thể được cấp cho hệ thống mà không sinh ra lượng nhiệt vượt quá mức cho phép (lượng nhiệt sinh ra do dòng lớn). Vì phương pháp này được thiết kế để phân tách protein dựa trên nguyên tắc điểm đẳng điện nên ta phải chú ý tới một vấn đề đó là hệ số ma sát trong việc phân tách các đại phân tử, nói cách khác kích thước lỗ của gel phải đủ lớn để sao chỗ các đại phân tử có thể di chuyển tự do tới vị trí điểm đẳng điện của chúng. Nếu kích thước lỗ của chất nền giới hạn tốc độ di chuyển của các protein có khối lượng phân tử lớn thì điểm đẳng điện sẽ ảnh hưởng nhiều hơn tới quá trình phân tách. Khi gel polycrylamide được sử dụng trong quá trình này thì nồng độ acrylamide trong gel không được vượt quá 8%. Nếu muốn bạn có thể thực hiện điện di đẳng điện hội tụ bằng cách sử dụng phiến chất nền với vật liệu khác ví dụ agarose hoặc chất nền dạng lỏng trong đó có sử dụng độ chênh lệch mật độ sucrose làm tác nhân khử đối lưu. Trên thị trường có sẵn ampholte với rất nhiều dải pH khác nhau phục vụ cho việc phân tách các phân tử theo yêu cầu (vd, pH 3-5, pH 2-10, pH 7-9…). Trước đây, điện di hội tụ đẳng điện thực hiện trong dạng phiến đã được sử dụng rộng rãi chỉ như một kỹ thuật phân tích. Gần đây thì hệ thống điện di hội tụ đẳng điện đã được cải tiến cho phép nó có thể được sử dụng trong việc chuẩn bị vật liệu (preparative) với tỷ lệ xích lớn và không biến tính bằng cách sử dụng môi trường điện di là chất lỏng có tác nhân khử đối lưu thay cho việc sử dụng phiến gel.

Điện di trên gel Agarose: Điện di trên gel agarose là kỹ thuật được sử dụng để xác định kích thước của acid nucleic có khối lượng phân tử cao (ADN và ARN). Agarose là chuỗi polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi galactose và 3,6-galactose khan (anhydrogalactose) được liên kết thông qua liên kết glycosidic, agarose được tách chiết từ tảo biển. Polyme agarose có thể chứa tới 100 đơn vị monomer, với khối lượng phân tử trung bình vào khoảng 10000 Da. Agarose được đúc bằng cách hòa tan bột agarose trắng trong dung dịch đệm có chứa EDTA và Tris-acetate hoặc Tris-borate (hệ đệm TAE hoặc TBE tương ứng). Khi hỗn hợp được gia nhiệt tới gần nhiệt độ sôi thì bột agarose hòa tan trong đệm tạo thành một dung dịch trong suốt. Sau đó dung dịch được làm làm mát tới nhiệt độ phòng, liên kết hydro trong và giữa các đơn vị polygalactose trong dung dịch sẽ hình thành nên loại gel rắn với kích thước lỗ tương đối đồng nhất. Quá trình polyme hóa này không liên quan đến các phản ứng hoá học, không giống như quá trình xảy ra đối với gel polyacrylamide đã mô tả bên trên.

Cũng giống như đối với gel polyacrylamide, kích thước lỗ của gel agarose cũng có thể được kiểm soát bằng cách thay đổi phần trăm của agarose hòa tan trong dung dịch. Với phần trăm agarose cao (3% wt/wt) sẽ thu được gel có kích thước lỗ lớn hơn loại có nồng độ thấp hơn (0.8% wt/wt). Phần trăm của agarose sẽ quyết định kích thước của các phân tử khác nhau có thể được xử lý trong quá trình điện di; gel có nồng độ agarose cao (kích thước lỗ nhỏ) có thể phân tách phân tử có khối lượng nhỏ hơn trong khi gel có nồng độ agarose thấp sẽ phân tách được phân tử có khối lượng lớn hơn. Phạm vi phân tách hiệu quả của gel agarose với nồng độ agarose khác nhau được liệt kê trong bảng 3.

Sau khi dung dịch được đun nóng để hòa tan agarose chúng sẽ được làm lạnh ngay tức khắc và và được đổ vào khuôn dạng phiến bịt kín một đầu cùng với Teflon hoặc hoặc lược nhựa. Sau khi quá trình polymer hóa dung dịch kết thúc lược nhựa sẽ được lấy ra khỏi gel để lại các lỗ gọi là các giếng, và mẫu ADN hoặc ARN sẽ được tra vào các giếng đó. Gel sau đó sẽ được đưa vào buồng điện di và được để  hoàn toàn trong đệm TAE hoặc TBE (các đệm được sử dụng để đúc gel). Tiếp theo mẫu acid nucleic sẽ được trộn với một hệ đệm nhớt (chứa 30% glycerol) có chứa thuốc nhuộm đánh dấu dùng để theo dõi quá trình điện di. Chất đánh dấu Bromphenol màu xanh sẽ di chuyển bằng vận tốc di chuyển của 1 phân tử ADN khoảng 500 bp, trong khi xylene cyanole sẽ di chuyển với vận tốc của một phân tử ADN 4000 bp.

Các mẫu acid nucleic được đưa vào các giếng của gel, mẫu ADN đã biết trước khối lượng phân tử (số bp) cũng được đưa vào một trong các giếng đó. Mẫu chuẩn này được sử dụng để xác định kích thước của mẫu acid nucleic chưa biết sau khi kết thúc quá trình phân tách điện di (xem bên dưới). Nhớ rằng ADN tích điện âm, do đó cathode (điện cực âm) nên được đặt ở phía gần với khu vực giếng đặt mẫu trong khi anode (điện cực dương) nên được đặt tại vị trí đối diện. Điện áp có giá trị khoảng 4 đến 6 V/m sẽ được cấp cho hệ thống (tạo ra dòng (50-70mA), quá trình điện di sẽ tiếp diễn tới khi chất đánh dấu màu xanh bromophenol chạm tới một đầu của gel. Cần phải chú ý rằng điện di trên gel agarose không giống với SDS-PAGE ở chỗ là nó không sử dụng gel cô (stacking gel). Vì acid nucleic trong mẫu có ma sát trên gel lớn hơn so với ma sát trên hệ đệm có trong giếng, do đó chúng nhanh chóng tập trung tại mặt tiếp giáp giữa gel và bộ đệm trước khi đi vào trong chất nền.

Làm thế nào để quan sát các acid nucleic sau quá trình điện di? Ethidium bromide là một chất nhuộm huỳnh quang có khả năng xen vào giữa các bazơ acid nucleic xếp song song (ví dụ, ADN xoắn kép). Kết thúc quá trình điện di, gel được đặt trong dung dịch đệm TBE hoặc TAE có chứa ethidium bromide để chất này khuếch tán vào trong gel và liên kết với các acid nucleic. Tiếp theo là quá trình tẩy nhuộm ngắn trong  đệm không chứa ethidium bromide (để loại bỏ ethidium bromide khỏi bề mặt của gel ở những nơi mà không có acid  nucleic), sau đó gel được soi dưới ánh sáng tia cực tím (UV – có bước sóng 256-300 nm) làm lộ ra các đoạn acid nucleic có băng huỳnh quang màu cam hoặc hồng trên gel. Các băng huỳnh quang này được ghi lại bằng việc chụp ảnh gel trong một buồng tối trong khi gel được chiếu án sang UV. Sử dụng một bộ lọc để lọc các tia cực tím do đó hầu hết aánh sáng chiếu lên phim là từ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các băng acid nucleic chứa các liên kết với edithium bromide.

Phương pháp để xác định khối lượng phân tử của một acid nucleic chưa biết hoàn toàn giống với phương pháp xác định khối lượng phân tử protein trong SDS-PAGE. Đồ thị hàm log của khối lượng phân tử acid nucleic với kích thước đã biết so với độ linh động tương đối của chúng được xây dựng sẵn như một hàm chuẩn, từ đó với độ linh động tương đối trong cùng một loại gel của các đoạn acid nucleic chưa biết ta có thể xác định được khối lượng phân tử và số lượng cặp bazơ một cách dễ dàng dựa vào đường chuẩn (một bazơ đơn lẻ có khối lượng trung bình xấp xỉ 320 Da còn một cặp bazơ đơn lẻ có khối lượng phân tử cỡ 640 Da).

Xem bài Điện di (Phần 1)

Tài liệu tham khảo:

Robert L. Switzer, Liam F. Garrity (1999), Experimental Biochemistry third edition, ISBN-13: 978-0716733003, New York.

Dịch giả: Bùi Ngọc Hà

Hiệu chỉnh và tổng hợp: BioMedia VN